Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
НЕВОССТАНОВЛЕННЫЕ УСЛОВИЯ
Для ряда испытаний полная диссоциация белка на субъенидичные пептиды невозможна. Из-за отсутствия восстанавливающих агентов, таких как 2-меркаптоэтанол или ДТТ, дисульфидные ковалентные связи становятся недоступными, сохраняя олигомерную форму белка. Олигомерные ДСН-белковые комплексы мигрируют свободнее, чем их ДСН-полипептидные субъединицы. Кроме того, невосстановленные белки не могут быть целиком насыщены ДСН и, соответственно, поэтому не могут связывать детергент с постоянным соотношением масс. Это делает молекулярно-массовое определение этих молекул с помощью ДСН-ПАГ неадекватным в сравнении с анализом полностью денатурированных полипептидов, так как необходимо наличие стандартов, которые имеют идентичную с испытуемым неизвестным белком конфигурацию для адекватного сравнения. Напротив проявление одной полосы в таком геле является критерием чистоты белка.
СВОЙСТВА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ С ПРЕРЫВИСТОЙ БУФЕРНОЙ СИСТЕМОЙ
Наиболее широко используемый электрофоретический метод исследования сложных белковых смесей включает использование прерывистой буферной системы, который состоит из двух гелей: разрешающего или разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Два геля отличаются пористостью, рН и ионной силой. Кроме того, используются разные по подвижности ионы в геле и электродных буферах. Буферная прерывистость приводит к концентрации большого объема образцов в концентрирующем геле и улучшению их разделения. При прохождении тока через испытуемый раствор падает напряжение, что вносит белки в концентрирующий гель. Ионы глицината с электродного буфера движутся за белками в концентрирующий гель. Быстро образуется область подвижной границы с высокоподвижными ведущими хролид-ионами и относительно медленными замыкающими ионами глицината. Образуется локализованный высоковольтный градиент между фронтами лидирующих и отстающих ионов, заставляя ДСН-белковые комплексы формировать тонкие зоны (полосы) и мигрировать между фазами хлорида и глицината. В широких границах, независимо от высоты нанесенного образца, все ДСН-белки конденсируются в очень узкую область и движутся к разделяющему гелю в виде четко определяемой тонкой зоны с высокой плотностью белка. Крупнопористый концентрирующий гель не задерживает миграцию большинства белков и, в основном, служит антиконвекторной средой.
На поверхности как концентрирующего, так и разделяющего гелей белки встречаются с резким возрастанием эффекта задерживания вследствие ограниченного размера пор разделяющего геля. Одновременно движение белков разделяющего геля продолжает замедляться вследствие ситовых свойств матрицы. Ионы глицината догоняют белки, а затем передвигаются в пространстве с постоянным рН, образованным трис(гидроксиметил)аминометаном и глицином. Молекулярно-ситовые свойства фазы приводят к разделу ДСН-полипептидных комплексов по их молекулярным массам.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНЫХ ПРЕРЫВИСТО-БУФЕРНЫХ ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ
Составление кассет, формирующих гель. Две стеклянные пластинки (например, размером 10 см х 8 см), политетрафторэтиленовую гребенку, две прокладки и силиконовые трубки (например, диаметром 0.6 мм и длиной 35 см) моют с мягким детергентом и ополаскивают водой. Все указанное сушат бумажным полотенцем или тканью. Прокладки и трубки смазывают несиликоновым маслом. Прокладки укладывают вдоль двух коротких сторон стеклянных пластин на расстоянии 2 мм от их краев и 2 мм от длинной стороны, являющейся дном геля. Используя одну прокладку в качестве основы, начинают укладывать трубку. Осторожно просовывают трубку к низу прокладки и протягивают вдоль длинной стороны стеклянной пластинки. Придерживая трубку вдоль длинной стороны пластинки, укладывают трубку по короткой стороне стеклянной пластинки, используя прокладку в качестве направляющей. Накрывают другой стеклянной пластинкой, плотно прижимая кассету руками. Устанавливают по два зажима на две короткие стороны кассеты. Осторожно устанавливают четыре зажима на длинную сторону кассеты геля, формируя дно кассеты. Необходимо удостовериться, чтобы трубка проходила вдоль края стеклянной пластинки и нигде не выдавливалась при размещении зажимов. Кассета готова для заливания гелем.
Приготовление геля. В случае прерывистого буферного ДСН-полиакриламидного геля рекомендуется залить разделительный гель, дождаться его полимеризации и затем залить концентрирующий гель, поскольку гели отличаются содержанием акриламида-бисакриламида, буфером и рН.
Приготовление разделительного геля. В конической колбе готовят соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования геля, используя указания, приведенные в Табл. 2.2.31.-1.
Компоненты смешивают в указанной последовательности. Если необходимо, перед прибавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) раствор фильтруют под вакуумом сквозь ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0.45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭД, как указано в Табл. 2.2.31.-1, взбалтывают и сразу заливают в пространство между двумя пластинками кассеты. Оставляют необходимое место для формирующего геля (к длине зубца гребеня прибавляют 1 см). Используя заостренную стеклянную пипетку, осторожно наслаивают насыщенный водой раствор изобутанола. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре до полимеризации.
